一、 產品描述

本產品為 STEMCELL Technologies 公司自主研發(fā)并生產的專業(yè)免疫細胞負向分選試劑，廣泛應用于基礎醫(yī)學研究、免疫學機制探索以及細胞治療等領域的前置樣本處理環(huán)節(jié)。該產品依托成熟的免疫密度分離技術，能夠在無需柱純化或磁力架等特殊設備介入的條件下，實現(xiàn)從人源外周血或白膜層中高效、溫和地富集天然殺傷（NK）細胞。

具體產品基礎參數(shù)如下：

•   中文名稱：RosetteSep™ 人 NK 細胞富集抗體混合物

•   英文名稱：RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail

•   國際通用貨號：提供兩種常用規(guī)格，分別為 #15025 與 #15065

•   品牌淵源：STEMCELL Technologies，秉承 "Scientists Helping Scientists" 的理念

•   核心規(guī)格：貨號 #15025 為標準裝，內含 2mL 抗體混合物試劑；貨號 #15065 為大包裝，內含 5 支獨立 2mL 試劑（共 10mL），充分滿足不同通量與頻次的中長期實驗規(guī)劃需求。

•   主要靶點：通過特異性的四聚體抗體復合物，精準識別并靶向結合非 NK 細胞群體及紅細胞。

•   適用種屬：人（Human）

•   適用樣本：肝素鈉抗凝的新鮮人外周全血、白細胞單采產物（Leukapheresis）、骨髓樣本或白膜層（Buffy coat）。

•   核心技術分類：基于抗體的免疫密度負向分選（Immunodensity Negative Selection）。

本品在典型的實驗操作中，配合密度梯度離心介質（推薦搭配同品牌 Lymphoprep™ 產品號 #18060 或 RosetteSep™ DM-L 產品號 #15705），可直接從 200mL 全血或其等效體積的白膜層中獲取邊界清晰的 NK 細胞群。分選后的細胞純度通常在 80% - 98% 之間（以 CD56+ 細胞占比計），且細胞表面無任何標記物殘留，保持了高的生物學活性和天然功能狀態(tài)。

二、 產品核心特點與優(yōu)勢

1. 操作極簡，流程迅捷

   整個實驗設計摒棄了傳統(tǒng)磁珠分選所需的繁瑣洗滌、孵育和過柱步驟。研究人員僅需將本品按比例加入血液樣本中簡單混勻，隨后直接鋪入含有密度離心液的離心管內進行單次離心即可。這種極簡的操作邏輯不僅大幅縮短了樣本處理時間（全過程通常可在 1.5 小時內完成），也極大降低了因人為操作誤差導致樣本報廢的風險。

2. 免除特殊設備依賴，節(jié)約實驗室預算

   不同于需要昂貴磁架、復雜流路系統(tǒng)或專門操作培訓的分選平臺，本產品的實驗過程依賴于實驗室標配的離心機。這一特性使得該試劑盒具普適性，無論是資源充裕的大型研究中心，還是初創(chuàng)型生物科技企業(yè)，均可零門檻快速上手，有效降低科研成本。

3. 溫和非接觸式分選，保障細胞功能完整性

   作為一種基于“負選"邏輯設計的試劑，其四聚體抗體復合物僅靶向標記不需要的細胞（如 T 細胞、B 細胞、單核細胞、粒細胞及紅細胞），而目標 NK 細胞在整個過程中始終保持未標記的原始狀態(tài)。這種非侵入式的分選策略，確保了分選后的 NK 細胞表面受體不受干擾，為后續(xù)開展細胞毒性 assay、細胞培養(yǎng)擴增、基因轉導或流式細胞術表型分析等高靈敏度下游功能實驗提供了堅實的質量基礎。

4. 兼容高通量體系，結果穩(wěn)定均一

   當與 STEMCELL 的 SepMate™ 離心管聯(lián)合使用時，能夠有效防止離心過程中紅細胞層的擾動與返混，實現(xiàn)了高度一致的可重復性結果，特別適合需要處理大體積樣本（如 200mL 全血）或追求標準化操作流程（SOP）的工業(yè)級應用。

三、 儲存條件與保質期

為了保證抗體復合物的生物活性和穩(wěn)定性，正確的儲存方式至關重要。

•   儲存溫度：本品須在 2°C 至 8°C 的醫(yī)用冰箱中進行冷藏保存。

•   避光要求：試劑瓶應始終保持在原裝盒內或避光環(huán)境中，避免光照直射導致蛋白變性。

•   防凍保護：切勿將本品冷凍（低于 0°C），凍結會導致抗體空間構象不可逆破壞，致使試劑失效。

•   有效期：在遵守上述儲存條件的前提下，產品自生產之日起具有確定的保質期限（具體日期請見產品外包裝標簽）。開封后，建議在規(guī)定周期內使用完畢，每次取用后應立即擰緊瓶蓋并迅速放回冷藏環(huán)境。

四、 工作原理詳解（免疫密度分離機制）

1. 多重靶向結合與玫瑰花環(huán)（Rosette）形成：

   試劑中含有的四聚體抗體復合物具有雙重特異性。一方面，它們能夠識別并結合存在于非目標細胞（如 T 細胞、B 細胞、單核細胞等）表面的特定抗原；另一方面，這些抗體也能識別紅細胞（RBC）表面的特異性分子。在樣本孵育階段，這些抗體就像一把把“分子橋梁"，將各類非 NK 的白細胞與周圍的紅細胞緊密交聯(lián)在一起，形成一個個多細胞的聚集體，在細胞生物學中被稱為“玫瑰花環(huán)"結構。

2. 密度的動態(tài)轉移：

   正常情況下，淋巴細胞（包括 NK 細胞）的密度較低，在密度梯度離心（如使用 Lymphoprep™）時會漂浮至上層的血漿與分離液界面。然而，那些被抗體交聯(lián)了眾多紅細胞的非目標細胞，由于結合了大量的高密度紅細胞，其整體的沉降系數(shù)顯著增加，密度變得遠大于常規(guī)的淋巴細胞。

3. 差異離心與純化：

   當樣本在密度梯度介質上進行離心時，高密度的“非目標細胞-紅細胞"玫瑰花環(huán)會克服浮力，穿過密度屏障，與游離的紅細胞一起沉降至管底；而未被標記的 NK 細胞由于密度較低，且未結合紅細胞，順利上浮并停留在血漿與密度梯度離心液的交界界面處。研究人員只需吸取該界面的白膜層，即可獲得高度富集的 NK 細胞懸液。

通過這種物理密度與免疫學靶向相結合的巧妙設計，實現(xiàn)了在不涉及磁性顆?；驅游鲋那闆r下，對目標細胞進行高純度、高得率的分離。

五、 解決的核心實驗痛點與科研應用場景

1. 攻克大體積樣本處理難題：

   ?   痛點：常規(guī)磁珠分選柱的處理通量有限，當面對諸如 200mL 全血或白細胞單采產物時，極易發(fā)生柱堵塞，且需要昂貴的大容量專用磁場設備。

   ?   本品對策：基于離心法的物理分離機制，只要離心機轉子允許，樣本體積幾乎不受限。配合大容量離心瓶或 SepMate™ 專用離心管，可輕松、穩(wěn)定地完成從 40mL 至 200mL 甚至更大體積全血的 NK 細胞富集，非常契合臨床級細胞制備的需求。

2. 消除試劑殘留對下游功能實驗的干擾：

   ?   痛點：許多磁珠分選試劑盒需要在目標細胞上直接偶聯(lián)抗體或微球，這些外來物質若清洗不凈，會阻礙后續(xù)的流式抗體染色，或影響 NK 細胞與靶細胞的識別結合，導致細胞毒性實驗結果出現(xiàn)嚴重偏差。

   ?   本品對策：堅持“負選"策略，讓 NK 細胞“毫發(fā)無損"地通過分離過程。沒有熒光標簽、沒有磁性顆粒、沒有交聯(lián)抗體，細胞處于的“原生態(tài)"，適配后續(xù)的細胞內細胞因子檢測（如 IFN-γ 分泌分析）、信號通路磷酸化研究以及體內外殺傷功能驗證。

3. 提升珍貴臨床樣本的利用率與活性：

   ?   痛點：某些罕見病患者或特定動物模型采集到的血液樣本極為有限，傳統(tǒng)方法繁瑣的洗滌和離心步驟容易造成細胞機械損傷和黏附損失，導致最終獲得的細胞數(shù)量不足以支撐下游實驗。

   ?   本品對策：直接將抗凝全血加入試劑混勻即可上機離心，極大減少了樣本轉移和開蓋次數(shù)。封閉的系統(tǒng)（如配合 SepMate™ 試管）還能降低氣溶膠污染風險，最大限度地回收珍貴的原生細胞。

主要研究領域與應用方向：

•   NK 細胞生物學研究：探究 NK 細胞的發(fā)育、亞群分布及功能調節(jié)機制。

•   腫瘤免疫學與細胞治療：作為 CAR-NK 療法開發(fā)中的起始細胞富集步驟，或在體外擴增前獲取高純度種子細胞。

•   感染免疫學：研究 NK 細胞在抗病毒（如 SARS-CoV-2 等）免疫反應中的激活狀態(tài)與清除機制。

•   免疫監(jiān)測與診斷：從患者外周血快速富集 NK 細胞，用于后續(xù)的免疫表型分析或細胞因子分泌譜檢測。

六、 標準實驗操作流程（Step-by-Step Guide）

為了確保您獲得最佳的實驗結果，請務必在開始實驗前仔細閱讀并理解以下操作步驟。建議整個操作過程在室溫（18°C - 25°C）下進行，所用試劑需提前平衡至室溫。

第一部分：實驗前準備

1. 試劑平衡：從 4℃ 冰箱取出 RosetteSep™ 人 NK 細胞富集抗體混合物、密度梯度離心液（如 Lymphoprep™ 或 RosetteSep™ DM-L）以及 DPBS（含 2% 胎牛血清），置于室溫下靜置平衡至少 30 分鐘。

2. 樣本準備：采集健康供體的新鮮外周全血，必須使用肝素鈉（Heparin）作為抗凝劑。如果使用之前冷凍保存的樣本，需先復蘇并將細胞濃度調整為 2 - 5 x 10^7 cells/mL，并補充加入 2% FBS。

3. 設備預熱：確保離心機轉子處于室溫環(huán)境。

第二部分：抗體孵育與離心分離

1. 抗體添加：根據(jù)您的樣本體積，按照試劑盒說明書推薦的比例，將 RosetteSep™ 抗體混合物直接加入到全血或白膜層樣本中。輕輕上下吹吸混勻，切勿劇烈渦旋震蕩。

2. 孵育：將混合好的樣本在室溫下靜置孵育 15 至 20 分鐘。此步驟旨在讓抗體充分結合靶細胞并形成穩(wěn)定的玫瑰花環(huán)結構。

3. 鋪設密度梯度離心液：取一支干凈的離心管（若處理大體積樣本，推薦使用 SepMate™-50 離心管），向管中加入預先計算好體積的濃度梯度離心液。

4. 樣本疊加：將孵育好的血液樣本非常緩慢地、沿管壁逐滴加入到密度梯度離心液的上層。注意盡量避免兩層液體發(fā)生混合，保持清晰的液面分界。

5. 離心分層：將離心管對稱放入轉子中，設定離心機為室溫，以 800g - 1000g 的加速度進行 15 至 20 分鐘的離心（具體參數(shù)視離心機型號和樣本體積微調）。

6. 收集目標細胞：離心結束后，小心取出離心管。此時管底為沉積的紅細胞和不需要的白細胞，中間為透明/半透明的密度梯度離心液，最上層為血漿層。目標 NK 細胞富集在密度梯度離心液與上層血漿的狹窄交界面處（呈云霧狀白膜層）。使用移液器小心吸取該界面層，轉移至一個新的潔凈離心管中。

第三部分：洗滌與重懸

1. 稀釋樣本：向收集到的界面細胞懸液中加入適量預冷的 DPBS（含 2% FBS）進行稀釋，以降低密度梯度介質的粘度。

2. 二次離心：在 4℃ 條件下，以 300g - 400g 離心 5 - 10 分鐘，棄去上清液（注意不要觸及管底細胞沉淀）。

3. 重懸計數(shù)：用適量的預冷 DPBS（含 2% FBS）或培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。取少量細胞進行臺盼藍染色計數(shù)，評估細胞活率和濃度；另取部分細胞進行流式細胞術分析（如檢測 CD56 表達），以確定 NK 細胞的富集純度。

七、 常見問題深度剖析與解決方案（Troubleshooting）

問題 1：目標 NK 細胞的回收率（得率）低于預期

•   可能原因 1：試劑或樣本溫度過低。

   ?   深度解析：低溫會導致紅細胞變硬，影響其柔性，從而降低抗體介導的細胞交聯(lián)效率，使得部分非目標細胞未能形成足夠密度的聚集體，在離心時錯誤地進入了目標界面層，間接導致目標細胞層被稀釋或丟失。

   ?   解決方案：嚴格執(zhí)行室溫平衡步驟。確保所有涉及反應的試劑（抗體、密度液、PBS）以及離心機轉子均處于 18°C - 25°C 的室溫環(huán)境。

•   可能原因 2：樣本細胞濃度過高。

   ?   深度解析：如果樣本中核細胞濃度超過 5 x 10^7 cells/mL，抗體分子可能無法在有效時間內充分接觸到所有靶細胞，導致交聯(lián)不全。

   ?   解決方案：在添加抗體前，使用 PBS + 2% FBS 將樣本稀釋，確保細胞濃度處于試劑盒推薦的最佳線性范圍內。

•   可能原因 3：吸取界面層時操作不當。

   ?   深度解析：吸取上清時吸入了過多的上層血漿，或者丟棄上清時誤吸掉了管底的珍貴細胞沉淀。

   ?   解決方案：優(yōu)化移液器操作手法，建議更換新的無菌吸頭進行多次少量吸取。在肉眼難以分辨時，可預留少量液體在管底，確保不丟失沉淀。

問題 2：分選后的 NK 細胞純度不高（夾雜過多其他淋巴細胞）

•   可能原因 1：樣本疊加時發(fā)生湍流混合。

   ?   深度解析：在將血液樣本鋪加到密度梯度離心液上時，如果手法過快或角度不對，導致兩層液體提前混合，破壞了密度梯度的穩(wěn)定性，使得非目標細胞未能有效沉降。

   ?   解決方案：放慢加樣速度，可以使用移液器將樣本貼壁緩慢滴加，或者使用長頸移液管伸入管底上方緩慢釋放樣本，保持兩層液體的絕對清晰界限。

•   可能原因 2：離心力或離心時間設置不當。

   ?   深度解析：離心力過大或時間過長，可能會將一些密度稍低的非目標細胞強行壓入界面層；反之，離心不足則可能導致紅細胞去除不干凈。

   ?   解決方案：根據(jù)離心機半徑，精確計算所需的相對離心力（RCF），并嚴格控制離心時間。建議進行預實驗以確定該批次樣本的最佳離心參數(shù)。

問題 3：最終產物中出現(xiàn)紅細胞（RBC）污染

•   可能原因 1：抗體比例不足或紅細胞數(shù)量不夠。

   ?   深度解析：該體系依賴于足量的紅細胞作為“沉降砝碼"。如果樣本中紅細胞比例異常偏低（例如某些貧血患者的樣本，或過度稀釋的樣本），非目標白細胞無法形成足夠密度的聚集體，從而殘留在界面層。

   ?   解決方案：嚴格按照說明書的體積比例添加抗體。若處理的是分離過白膜層或凍存復蘇的樣本，務必按說明書指示，補充加入適量新鮮的肝素抗凝全血作為紅細胞來源（通常為 250 µL 每 mL 樣本）。

•   可能原因 2：離心管底沉淀受到擾動。

   ?   深度解析：在吸取界面層細胞時，移液器吹打產生的渦流攪動了底部致密的紅細胞沉淀，導致下層液體混入上層。

   ?   解決方案：吸取時保持移液器吸頭始終處于界面層的中上部。若使用 SepMate™ 離心管，其有的多孔屏障能有效隔離沉淀，大幅降低此風險。如果手動吸取，動作需極其輕柔。對于極其輕微的紅細胞污染，可在收集后進行一次低滲裂解（如使用 ACK 裂解液）以去除殘留的紅細胞。

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（注：本文內容基于品牌公開資料及行業(yè)常規(guī)信息整理，具體以品牌信息文檔為準。）

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