PANAGENE FISH（熒光原位雜交）PNA 端粒探針方案

PANAGENE F1001

原則上，熒光原位雜交 (FISH) 應該能夠提供單個染色體端粒長度的信息。直接標記的寡核苷酸探針由于其體積小（良好的穿透特性）、單鏈性質（探針無變性）和受控的合成，是此類分析的有吸引力的探針。然而，端粒重復序列的寡核苷酸雜交的效率還不足以將這種方法擴展到各種物種染色體中 TTAGGG 重復序列的定性研究之外。近研究表明，肽核酸 (PNA) 寡核苷酸探針將與互補的寡核苷酸序列雜交，產生的雙鏈比 DNA/DNA 或 DNA/RNA 雙鏈更穩定。在 PNA 中，傳統 DNA 和 RNA 寡核苷酸的帶電磷酸-（脫氧）核糖骨架被通過肽鍵連接的重復 N-（2-氨基乙基）-甘氨酸單元的不帶電骨架取代。與 DNA 寡核苷酸相比，PNA 寡聚體表現出更高的序列特異性、改善的穩定性、重現性和更低的背景。由于 PNA/DNA 雙鏈的 Tm 較高，短（18 聚體）端粒 PNA (CCCTAA)3 應用廣泛。

開始前要做的事情二、雜交

1. 將載玻片置于 80 °C 預熱培養箱中 5 min。

I. 端粒 PNA 探針的制備

1. 打開試管前離心試管，以便在試管底部收集凍干 PNA 探針。

2. 向管中加入甲酰胺，得到 PNA 探針的儲備液。

3. 在 PNA 雜交緩沖液中將貯備液稀釋至終濃度 200 nM。

ü 注：將 PNA 探針溶液在 4 ℃ 下避光儲存。

II. 溶液制備

1. 雜交緩沖液

20 mM 鈉2HPO4, pH 7.4

20 mM Tris，pH 7.4

60% 甲酰胺 2X SSC

0.1µg/ml 鮭魚精子 DNA

2. RNase A 溶液

100µg/ml RNase A（2X SSC 中）

3. 胃蛋白酶 0.005% 溶液

50µl 5% 胃蛋白酶貯備液溶于 50 mL 0.01 MHCl 中。

ü 注：新鮮！使用前加熱至 45 ℃。

4. 洗滌液

2X SSC/0.1% 吐溫-20

雜交和洗滌

I. 預處理

1. 按照特定細胞系推薦的程序制備載玻片，并風干。

2. 將載玻片在 PBS 中浸泡 15 min。

3. 將載玻片在 4% 甲醛的 PBS 中 37 °C 固定 4 min。

4. 37 °C PBS 洗 5 min (X2)。

5. 向一個干凈的平板中加入 500µl RNase A 溶液，并將每個載玻片面朝下置于 RNase A 溶液上，在 37 ℃ 下孵育 1 h。

ü 注：注意不要干燥。

6. 在 2X SSC（X3 重復）中清洗，并在 DW 中清洗。

7. 在 37 °C 下，將載玻片在 0.005% 胃蛋白酶中浸泡 4 min。

8. 37 °C PBS 洗 3 min (X2)。

9. 重復步驟 3-4。

10. 室溫下在 PBS 中清洗 5 min。

11. 在冷乙醇系列中脫水載玻片（在 70%、85%、100% 中脫水 1 min）。

12. 晾干載玻片。

2. 向每張載玻片的標記區域加入 20µl PNA 探針的雜交緩沖液。

ü 注：使用前 90 °C 加熱雜交緩沖液 5 min。

3. 用 18 x 18 mm 蓋玻片覆蓋載玻片上的標記區域。

ü 注：注意不要干燥。

4. 將載玻片在 85 °C 下變性 10 min。

ü 注：變性應在低 80 ℃ 和高 90 ℃ 之間進行。

仔細檢查培養箱的溫度。75 °C 以下的變性溫度嚴重損害結果。

5. 將載玻片在室溫下避光放置 1 h。

III. 洗滌

1. 在室溫下將載玻片浸入洗滌液中，以取出蓋玻片。

2. 在 55‐60 °C 下用清洗液清洗載玻片 10 min (X2)。

ü 注：應在 55-60 ℃ 下進行清洗。

3. 將載玻片在清洗液中清洗 1 min

室溫。

IV. 復染

1. 將載玻片在 DAPI/2X SSC 中染色 10 min。

2. 在 2X SSC 中清洗載玻片 2 min。

3. 在 1X SSC 中清洗載玻片 2 min。

4. 在 DW 中清洗載玻片 2 min。

5. 用離心機干燥載玻片。

6. 在載玻片的目標區域滴一滴封片劑。

7. 蓋上蓋玻片，使溶液均勻分布在蓋玻片下。避免產生氣泡。

8. 使用帶有適當濾光片的熒光顯微鏡觀察染色載玻片。

V. 參考文獻

1. Kentaro Taemura等人2005,Developmental Biology 281,196‐207.

2. Won‐Woo Lee等人2002,Immunology 105,458‐465.

3. Heather Perry.等人。2001,Journal of Microbiological Methods 47,281‐292.

4. 陳彩福等人。1999，哺乳動物基因組 10，13‐18。

5. M. Hultdin等人。1998,Nucleic Acids Research 26 (16) ,3651‐3656.

6. Peter M. Landsdorp等人。1996,Human Molecular Genetics 5 (5) ,685‐691.